Ein großer Teil der Arbeit eines Wissenschaftlers besteht darin, Experimente zu planen und durchzuführen.
Die Kombination von Labortechniken wird die meisten der von den Wissenschaftlern vorgeschlagenen Fragen beantworten, und der Arbeitsablauf, um neue Methoden vorzuschlagen, hängt von dem Hintergrund und der Erfahrung des Wissenschaftlers ab.
Für Biologen können Zellbilder viel darüber aussagen, was in den Prozessen und Mechanismen vor sich geht, die sie untersuchen.
Lichtmikroskopie ist eine in den Biowissenschaften sehr weit verbreitete Technik.
Der Einsatz von Farbstoffen, Antikörpern und Fluoreszenzsonden ermöglicht es den Wissenschaftlern, in den Mikroskopzellen Bilder von Dingen zu sehen, die sonst zu klein waren, um sie zu sehen oder gar zu verstehen.
Fluoreszenzmikroskope und die Verwendung von Fluorochromen wurde 1930 möglich1und heute sind viele Kombinationen von Fluorochromen möglich, um Proteine, Organellen und Strukturen in Zellen und Geweben zu färben.
Fluorochrome (oder Fluorophore) sind Moleküle, die, wenn sie mit einer bestimmten Lichtwellenlänge angeregt werden, Licht mit einer bestimmten Wellenlänge aussenden, das von den Linsen eines Mikroskops eingefangen und in ein tatsächliches Bild umgewandelt wird.
Die Kombination von Fluoreszenz, Objektiven und Kameras ermöglicht es uns, die Vorgänge im Inneren von Zellen in vielen verschiedenen Ansichten und Aspekten abzubilden.
Mit dem Mikroskop können wir zum Beispiel einen Mausgehirnschnitt mit einem 2,5- oder 4-fach-Objektiv in einem größeren Rahmen betrachten und mit einem 63-fach-Objektiv kleine Details des untersuchten Aktin-Zytoskeletts in derselben Probe.
Um diese Tests zu ermöglichen, können wir Antikörper oder Farbstoffe gegen bestimmte Proteine in der Zelle oder im Gewebe verwenden, wobei der Antikörper in der Regel mit einem Fluorophor ausgestattet ist.
Die Stokes'sche Verschiebung erklärt dieses Phänomen: Fluorophore verlieren Schwingungsenergie in Form von emittiertem Licht, wenn sie von einem angeregten Zustand zurück in den Grundzustand wechseln. Fluoreszenzmikroskope liefern das Licht, um das Fluorophor anzuregen, und empfangen das emittierte Licht. Das emittierte Licht kann von einem Objektiv aufgefangen, in einer CCD-Kamera verarbeitet und in ein digitales Bild umgewandelt werden.
Aber wir werden später über die Aufnahme von Zellbildern sprechen. Jetzt sollten wir Ihnen Beispiele und Tipps für die wichtigsten Schritte vor der Aufnahme Ihres Bildes vorstellen.
Wie wählen und kombinieren wir verschiedene Arten von Farbstoffen und Antikörpern, um Beziehungen zwischen Organellen und Proteinen in Zellen oder Geweben zu erkennen und zu verstehen?
Zunächst müssen die Wissenschaftler entscheiden, welche Antikörper und Farbstoffe sie auf der Grundlage ihrer Forschung verwenden wollen.
Zum Beispiel, in diesem ArtikelMendonça versuchte, die Auswirkungen und potenziellen Risiken von kationischen festen Lipid-Nanopartikeln (cSLN) bei Ratten zu bewerten. Jedes Jahr werden zahlreiche Nanopartikel entwickelt und untersucht, um die Verabreichung von Medikamenten oder Genen zur Behandlung zahlreicher Krankheiten zu verbessern. Eine der interessanten Fragen in dieser Studie war, ob die Nanopartikel in der Lage sind, das Gehirn zu erreichen, indem sie die Blut-Hirn-Schranke überwinden. Diese Schranke schützt unser Gehirn vor zirkulierenden Giftstoffen oder Krankheitserregern, und normalerweise ist es nicht wünschenswert, dass Moleküle diese Schranke passieren. Aber in diesem speziellen Fall, Mendonça's Ziel war es, dass die Nanopartikel die Schranke überwinden und das Gehirn erreichen, um in einer zukünftigen Anwendung Medikamente oder Gene zu verabreichen.
Um zu sehen, ob die Nanopartikel im Hirnparenchym vorhanden waren, verwendeten die Autoren einen Endothelzellmarker für die Gefäße namens RECA-1 (in rot dargestellt), während die Zellkerne mit dem blauen Farbstoff DAPI (4′,6-Diamidino-2-Phenylindol) gefärbt wurden. Wir können auch kleine grüne Punkte für die Nanopartikel außerhalb der Gefäße sehen, was bedeutet, dass sie das Gehirnparenchym erreicht haben.
Sehen Sie sich die nachstehende Infografik mit einer Abbildung an.
Wir wollen verstehen, was der Antikörper für RECA-1 (rot) macht.
Diese Antikörper sind als spezifische Sonden konzipiert und richten sich gegen ein bestimmtes Antigen (in unserem Fall das Protein RECA-1).
Sie können mit einem Fluorophor markiert oder später durch einen mit einem Fluorophor verbundenen sekundären Antikörper erkannt werden.
Daher wird die Probe mit einer Lichtquelle angeregt, das spezifische Protein, nach dem Sie suchen, wird in Ihrer Probe durch die Emission von Licht einer bestimmten Wellenlänge erkannt.
Im Falle von DAPI handelt es sich um eine Nukleus- und Nukleosomen-Gegenfärbung, die bei der Bindung an AT-Regionen der DNA eine blaue Fluoreszenz abgibt.
Wie entwirft man ein Panel für die Immunfluoreszenz?
Beginnen Sie mit diesen Schritten:
- Kaufen (oder leihen! Die Wissenschaft sollte sehr kooperativ sein!) Sie die für Ihre Forschung notwendigen Antikörper und Farbstoffe. Bevorzugen Sie primäre Antikörper (ohne Sonden), und kaufen Sie sekundäre Antikörper, die spezifisch für die Wirtsspezies des primären Antikörpers sind. Wenn Sie z. B. einen primären Antikörper verwenden, der in Kaninchen hergestellt wurde, verwenden Sie einen sekundären Antikörper gegen Kaninchen. Dadurch wird die Spezifität gewährleistet.
- Die Verwendung von mit Fluorophoren markierten Sekundärantikörpern verstärkt das Signal, da mehr Antigene pro Primärantikörper nachgewiesen werden. Außerdem ist dies ein dynamischerer Weg, um verschiedene Assays auszuarbeiten, da der Forscher die Farben im Panel je nach Bedarf ändern kann.
- Ein weiterer wichtiger Schritt besteht darin, zu prüfen, welche Filter in Ihrem Mikroskop zur Verfügung stehen. Sie sollten sicherstellen, dass die Anregungs- und Emissionswellenlängen Ihrer Fluorophore innerhalb der Anregungs- und Emissionsfilter liegen; andernfalls können Sie das Emissionslicht Ihrer Sonden nicht erfassen. Sie können verwenden Fluoreszenzspektren-Betrachter um die Kompatibilität zu prüfen.
- So stellen Sie sicher, dass sich die Anregungs- und Emissionswellenlängen aller Ihrer Fluorophore und Farbstoffe innerhalb desselben Assays nicht überschneiden, Fluoreszenzspektren-Betrachter ist eine gute Wahl. Sie decken fast alle verfügbaren Fluorophore ab!
Prüfen Sie schließlich ein Beispiel für ein hypothetisches Experiment, bei dem wir Hoechst 33258 für die Nukleinsäuren und einen primären Antikörper gegen RECA-1 haben, der mit einem sekundären Antikörper Alexa Fluor 647 markiert ist.
Idealerweise verwenden wir ein Mikroskop mit einem DAPI-Würfel (Anregung 377/50 und Emission 447/60) und einem CY5-Würfel (Anregung 628/40 und Emission 685/40). Alle diese Informationen haben wir unter Fluoreszenzspektren-Betrachter und erhielt die Spektren für beide Farbstoffe sowie die Bandbreiten für beide Würfel (siehe das Spektrum in der Infografik oben).
Dieser hypothetische Aufsatz ist ein gutes Beispiel dafür, dass die Spektren der Fluorophore innerhalb der Anregungs- und Emissionsfilter liegen und es dem Forscher ermöglichen, seine Proben optimal zu erfassen.
Jetzt ist es an der Zeit, ins Labor zu gehen und alles in die Praxis umzusetzen!
Ich hoffe, diese Tipps helfen dir bei deinem nächsten Laborexperiment. Viel Glück!
Referenzen:
- Einführung in die Fluoreszenzmikroskopie. Nikons MikroskopieU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy. Zugriff am 2021-04-11 17:20:40.
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