Gran parte della routine dello scienziato consiste nel progettare ed eseguire esperimenti.
La combinazione di tecniche di laboratorio risponderà alla maggior parte delle domande proposte dagli scienziati e il flusso di lavoro per suggerire nuovi metodi dipende dal background e dall'esperienza dello scienziato.
Per i biologi, le immagini delle cellule possono dire molto su ciò che accade nei processi e nei meccanismi che stanno studiando.
Microscopia ottica è una tecnica molto diffusa nelle scienze biologiche.
L'uso di coloranti, anticorpi e sonde fluorescenti consente agli scienziati di vedere nelle cellule del microscopio immagini di ciò che altrimenti era troppo piccolo per essere visto e persino compreso.
Microscopi a fluorescenza e l'uso di fluorocromi è diventato possibile nel 19301Oggi sono possibili molte combinazioni di fluorocromi per colorare proteine, organelli e strutture all'interno di cellule e tessuti.
Fluorocromi (o fluorofori) sono molecole che, se eccitate con una specifica lunghezza d'onda della luce, emettono una luce di una lunghezza d'onda definita che verrà catturata dalle lenti di un microscopio e trasformata in un'immagine reale.
La combinazione di fluorescenza, lenti e fotocamere ci permette di scattare un'immagine dei processi all'interno delle cellule in molti punti di vista e aspetti diversi.
Ad esempio, utilizzando il microscopio, possiamo avere una visione più ampia di una fetta di cervello di topo con un obiettivo 2,5x o 4x, e piccoli dettagli del citoscheletro di actina analizzato nello stesso campione con un obiettivo 63x.
Per consentire questi saggi, possiamo utilizzare anticorpi o coloranti contro proteine specifiche presenti nella cellula o nel tessuto, e l'anticorpo di solito è dotato di un fluoroforo.
Lo spostamento di Stokes spiega questo fenomeno: i fluorofori perdono energia vibrazionale sotto forma di luce emessa quando passano da uno stato eccitato allo stato fondamentale. I microscopi a fluorescenza forniscono la luce per eccitare il fluoroforo e ricevono la luce emessa. La luce emessa può essere catturata da una lente, elaborata da una telecamera CCD e trasformata in un'immagine digitale.
Ma parliamo dell'acquisizione dell'immagine della cella in un secondo momento. Ora è opportuno presentare esempi e suggerimenti per le fasi principali che precedono l'acquisizione dell'immagine.
Come scegliamo e combiniamo diversi tipi di coloranti e anticorpi per vedere e capire le relazioni tra organelli e proteine all'interno di cellule o tessuti?
In primo luogo, gli scienziati devono determinare quali anticorpi e coloranti utilizzare in base alla loro ricerca.
Ad esempio, in questo articoloMendonça ha cercato di valutare gli effetti e i potenziali rischi delle nanoparticelle lipidiche solide cationiche (cSLN) nei ratti. Ogni anno vengono sviluppate e studiate molte nanoparticelle, con l'obiettivo di migliorare la somministrazione di farmaci o geni per il trattamento di molte malattie. Una delle domande interessanti di questo studio era se le nanoparticelle fossero in grado di raggiungere il cervello attraversando la barriera emato-encefalica. Questa barriera protegge il nostro cervello dalle tossine o dagli agenti patogeni in circolazione e di solito non è auspicabile che le molecole attraversino la barriera. Ma in questo caso particolare, Mendonça L'obiettivo era che le nanoparticelle attraversassero la barriera e raggiungessero il cervello, per veicolare farmaci o geni in un'applicazione futura.
Per verificare se le nanoparticelle fossero presenti nel parenchima cerebrale, gli autori hanno utilizzato un marcatore di cellule endoteliali per i vasi chiamato RECA-1 (rappresentato in rosso), mentre i nuclei delle cellule sono stati colorati con un colorante chiamato DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindolo) che è blu. Si possono anche osservare piccoli punti verdi per le nanoparticelle al di fuori dei vasi, il che significa che hanno raggiunto il parenchima cerebrale.
Guardate l'infografica qui sotto con un'immagine di rappresentazione.
Cerchiamo di capire cosa fa l'anticorpo per RECA-1 (rosso).
Questi anticorpi sono progettati per fungere da sonde specifiche e hanno come bersaglio un antigene specifico (nel nostro caso, la proteina RECA-1).
Possono essere marcati con un fluoroforo o riconosciuti successivamente da un anticorpo secondario legato a un fluoroforo.
Pertanto, dopo aver eccitato il campione con una sorgente luminosa, la proteina specifica che si sta cercando sarà riconosciuta nel campione grazie all'emissione di luce in una specifica lunghezza d'onda.
Nel caso del DAPI, questo colorante è un colorante di contrasto dei nuclei e dei nucleosomi ed emette una fluorescenza blu quando si lega alle regioni AT del DNA.
Come progettare un pannello per l'immunofluorescenza?
Iniziate con questi passaggi:
- Acquistate (o prendete in prestito! La scienza dovrebbe essere molto collaborativa!) gli anticorpi e i coloranti essenziali per la vostra ricerca. Privilegiate gli anticorpi primari (senza sonde) e acquistate anticorpi secondari specifici per la specie ospite dell'anticorpo primario. Ad esempio, se si utilizza un anticorpo primario prodotto nel coniglio, utilizzare un anticorpo secondario anti-coniglio. Questo garantirà la specificità.
- L'uso di anticorpi secondari marcati con fluorofori aumenta il segnale rilevando un maggior numero di antigeni per anticorpo primario. Inoltre, questo è un modo più dinamico di elaborare diversi saggi, perché consente al ricercatore di modificare i colori del pannello in base alle sue esigenze.
- Un altro passo importante è quello di verificare nel microscopio quali sono i filtri disponibili. È necessario assicurarsi che le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione del fluoroforo rientrino nei filtri di eccitazione ed emissione; in caso contrario, non sarà possibile catturare la luce di emissione delle sonde. È possibile utilizzare Visualizzatore di spettri di fluorescenza per verificare la compatibilità.
- Per assicurarsi che le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di tutti i fluorofori e coloranti non si sovrappongano all'interno dello stesso test, Visualizzatore di spettri di fluorescenza è un'ottima scelta. Coprono quasi tutti i fluorofori disponibili!
Infine, è possibile verificare un esempio per un ipotetico esperimento in cui abbiamo Hoechst 33258 per gli acidi nucleici e un anticorpo primario contro RECA-1 marcato con un anticorpo secondario Alexa Fluor 647.
L'ideale sarebbe utilizzare un microscopio con un cubo DAPI (eccitazione 377/50 ed emissione 447/60) e un cubo CY5 (eccitazione 628/40 ed emissione 685/40). Tutte queste informazioni sono state inserite in Visualizzatore di spettri di fluorescenza e abbiamo ottenuto gli spettri di entrambi i coloranti e le larghezze di banda di entrambi i cubi (guardate lo spettro nell'infografica qui sopra).
Questo ipotetico saggio è un buon esempio in cui gli spettri dei fluorofori si trovano all'interno dei filtri di eccitazione e di emissione, consentendo al ricercatore di catturare i suoi campioni nel modo migliore.
Ora è il momento di andare in laboratorio e mettere tutto in pratica!
Spero che questi consigli vi aiutino nel vostro prossimo esperimento di laboratorio. Buona fortuna!
Riferimenti:
- Introduzione alla microscopia a fluorescenza. MicroscopiaU di Nikon https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy. Accesso 2021-04-11 17:20:40.
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