科学者の日常業務の大部分は、実験を計画し、実行することである。
実験技術の組み合わせによって、科学者が提案するほとんどの疑問に答えることができ、新しい方法を提案するワークフローは、科学者のバックグラウンドと経験に依存します。
生物学者にとって、細胞の画像は、研究しているプロセスやメカニズムで何が起こっているのかについて、多くを語ることができます。
光学顕微鏡 は、生物科学の分野で非常に広く使われている技術です。
染料、抗体、蛍光プローブを使用することで、従来は小さすぎて見ることも理解することもできなかったものが、顕微鏡の細胞内に映し出されるようになったのです。
蛍光顕微鏡 と蛍光色素の使用 が可能になったのは1930年1現在では、多くの蛍光色素を組み合わせて、細胞や組織内のタンパク質、オルガネラ、構造物を染色することができる。
フルオロクロム(またはフルオロフォア) は、特定の波長の光で励起されると、決められた波長の光を放出し、それを顕微鏡のレンズでとらえ、実際の画像に変換する分子である。
蛍光、レンズ、カメラを組み合わせることで、細胞内のプロセスをさまざまな角度から撮影することができるのです。
例えば、顕微鏡を使って、2,5xや4xの対物レンズでマウスの脳切片を広く見渡し、63xの対物レンズで同じサンプルのプローブされたアクチン細胞骨格の細かい部分を見ることができるのです。
このようなアッセイを可能にするために、細胞や組織に存在する特定のタンパク質に対する抗体や色素を使用することができ、通常、抗体には蛍光体が付属しています。
ストークスのシフトは、蛍光体が励起状態から基底状態に戻るときに、発光という形で振動エネルギーを失うという現象を説明するものである。蛍光顕微鏡は、蛍光体を励起するための光を供給し、その放射光を受け取る。発光した光はレンズでとらえられ、CCDカメラ内で処理され、デジタル画像に変換されることができる。
しかし、細胞の画像取得については後で説明しましょう。では、画像を取得する前の主な手順について、例とコツを紹介しましょう。
細胞や組織内の小器官やタンパク質の関係を見るために、どのように色素や抗体を選び、組み合わせるか。
まず、研究者が自分の研究内容に基づいて、どの抗体や色素を使うかを決定する必要があります。
例えば、こんな感じです。 このうちMendonçaは、カチオン性固体脂質ナノ粒子（cSLN）のラットへの影響と潜在的なリスクを評価しようとしていました。毎年、多くのナノ粒子が開発・研究されており、多くの疾患を治療するために薬物や遺伝子の送達を強化することを目的としている。この研究で興味深いのは、ナノ粒子が血液脳関門を通過して脳に到達できるかどうかという点である。この関門は、循環する毒素や病原体から脳を守るものであり、通常、分子が関門を通過することは望ましいことではありません。しかし、この特殊なケースでは メンドクサの の目標は、ナノ粒子が障壁を越えて脳に到達し、将来的に薬物や遺伝子を送達するためのアプリケーションを開発することでした。
著者らは、ナノ粒子が脳実質に存在するかどうかを確認するため、RECA-1という血管内皮細胞マーカー（赤で表示）を用い、細胞核はDAPI（4′，6-ジアミノフェニルインドール）という色素（青）で染色した。また、血管の外側にあるナノ粒子は小さな緑色の点が観察され、これは脳実質に到達したことを意味します。
以下のインフォグラフィックで、表現イメージをご確認ください。
RECA-1（赤色）の抗体が何をしているのか理解しよう。
これらの抗体は特異的なプローブとして設計されており、特定の抗原（我々の場合はRECA-1というタンパク質）を標的としています。
これらは、蛍光色素で標識するか、蛍光色素と結合した二次抗体で後から認識させることができる。
そのため、光源で試料を励起した後。 特定の波長で発光することで、目的のタンパク質が認識されます。.
DAPIの場合、この色素は核やヌクレオソームのカウンターステインであり、DNAのAT領域に結合すると青い蛍光を発する。
免疫蛍光のパネルデザインはどのようにすればよいですか？
まずはこの手順で始めてみてください。
- 研究に必要な抗体や色素を購入する（または借りる！科学は非常に協力的であるべきだ！）。一次抗体（プローブなし）を優先し、一次抗体から宿主種に特異的な二次抗体を購入する。例えば、ウサギで産生された一次抗体を使用する場合は、抗ウサギ用の二次抗体を使用する。これにより特異性が保証されます。
- 蛍光色素で標識された二次抗体を使用すると、一次抗体あたりより多くの抗原を検出することができ、シグナルが増強されます。また、研究者のニーズに応じてパネルの色を変更できるため、様々なアッセイを精緻に行うことができる、よりダイナミックな方法と言えます。
- もう一つの重要なステップは、使用する顕微鏡にどのようなフィルターがあるのかを確認することです。蛍光体の励起波長と発光波長が励起・発光フィルター内にあることを確認する必要があり、そうでない場合はプローブからの発光光を捕らえることができません。使用できるのは 蛍光スペクトルビューア をクリックして互換性を確認してください。
- 同じアッセイ内で、すべての蛍光体や色素の励起波長と発光波長が重ならないようにすること。 蛍光スペクトルビューア がおすすめです。ほぼ全ての蛍光体を網羅しています!
最後に、核酸にHoechst 33258、RECA-1に対する一次抗体に二次抗体Alexa Fluor 647を標識した仮想実験の例を確認してください。
DAPIキューブ（励起377/50、発光447/60）とCY5キューブ（励起628/40、発光685/40）を備えた顕微鏡を使用することが理想的です。これらの情報はすべて 蛍光スペクトルビューア を作成し、両方の色素のスペクトルと、両方のキューブの帯域幅を取得しました（上のインフォグラフィックでスペクトルを確認してください）。
この仮説のエッセイは、蛍光体のスペクトルが励起と発光のフィルターの中に属している良い例で、研究者が自分のサンプルを最適な方法で捕らえることを可能にしています。
さあ、いよいよ研究室で、すべてを実践してみましょう
これらのヒントが、あなたの次のラボ実験に役立つことを願っています。幸運を祈ります。
参考文献
- 蛍光顕微鏡入門。 ニコンのマイクロスコープU https://www.microscopyu.com/techniques/fluorescence/introduction-to-fluorescence-microscopy.アクセス数 2021-04-11 17:20:40.
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